Elektronová mikroskopie
Mikroskopie se zabývá zobrazováním struktur pod hranicí rozlišovací schopnosti lidského oka pomocí mikroskopu. Podle typu mikroskopu se rozlišuje například mikroskopie světelná, elektronová a mikroskopie atomárních sil. Světelný mikroskop se svým zvětšením 1000x a rozlišovací schopností 200nm už nezaujímá hlavní místo ve světě pomocníka vědy a nahradil ho mnohem lepší elektronový mikroskop (EM) se zvětšením až 1 000 000x a s úžasnou rozlišovací schopností 0,2nm, který je pro dnešní vědu stěžejním přístrojem, ale samozřejmě nesmíme opomenout mikroskopii atomárních sil, která nám pomáhá zkoumat atomy a molekuly.
Od dob Anthony van Leeuwenhoeka, který sestavil první velmi primitivní mikroskop se až v roce 1931 podařilo německému vědci Ernstu Ruskovi a jeho učiteli Maxi Knollemovi sestavil na základě poznatků z fyziky a zkoumání magnetického pole první prozařovací (transmisní) elektronový mikroskop se zvětšením 400x. Před druhou světovou válkou se elektronový mikroskop začal sériově vyrábět ve firmě Siemens, což přispělo k jeho značnému rozšíření do laboratoří po celém světě. Ernst Ruska získal až v roce 1986 Nobelovu cenu za tento vynález.
V roce 1942 byl objeven rastrovací elektronový mikroskop (REM) v USA, jehož zvětšení bylo 50 000x, ale svého prvního komerčního využití se dočkal až okolo roku 1965.
Elektronový mikroskop využívá usměrněný proud elektronů ve vakuu, kde se nachází i celý systém, proto aby nedocházelo k interakcím elektronů s atmosférou. Obraz je pozorován na luminiscenčním stínítku nebo snímán CCD kamerou. Mezní rozlišovací schopnost mikroskopu je úměrná vlnové délce použitého záření, proto nám umožňuje elektronové záření s podstatně kratší vlnovou délkou mnohem vyšší rozlišovací schopnosti.
Elektronové mikroskopy dělíme na transmisní (TEM), rastrovací neboli skenovací (REM, SEM), skenovací-transmisní (STEM) a enviromentální (ESEM), který nám umožňuje zkoumat vzorky s vodou a má volitelné vakuum.
Transmisní elektronový mikroskop funguje pomocí nepohyblivého svazku elektronů, detekci elektronů prošlých preparátem na fluorescenčním stínítku nebo detektorem. Zdrojem proudu elektronů je wolframová katoda, která vysílá elektrony urychlované elektrickým polem o napětí 50 až 200kV (α elektronu ± 0,004nm). Proud elektronů prochází kondenzorem, který soustřeďuje elektrony na pozorovaný preparát a poté proud elektronů prochází objektivem a vytváří první elektronový obraz. Část obrazu se projektivem zvětší a promítne se na stínítko pokryté vrstvou luminoforu nebo se zachytí na fotografické desce či filmu. Vše musí být umístěno ve vakuu kvůli částečkám vzduchu, které by mohli vést k rozptýlení proudu elektronů. Maximální zvětšení je 1 000 000x, ale užitečné 100 000 – 200 000x. Záznam obrazu bývá zdokumentován na plochý film o rozměrech 65x90nm, 35nm film bez perforace, digitální kameru (CCD) a monitor počítače. Při přípravě preparátů musíme dávat zvlášť pozor z důvodů, že preparáty musí být velice tenké a nesmí přijít do styku s vodou. Příprava pomocí ultratenkých řezů, značení preparátů pomocí koloidního zlata, negativního barvení, repliky, stínování a mrazového lámání, které probíhá při -196ºC.
Ultratenké řezy nám slouží k fixaci, postfixaci, odvodnění, prosycení a zalití do polymerové pryskyřice, polymeraci, ke krájení pro světelný mikroskop a krájení na EM síťku.
Rastrovací neboli skenovací elektronový mikroskop funguje pomocí pohyblivého svazku elektronů, zobrazení povrchu preparátu pomocí sekundárních elektronů, odražených elektronů, případně signálu z jiných detektorů. Na každé místo preparátu je zameřen úzký paprsek elektronů (prochází jej po řádcích). Vzájemným působením dopadajících elektronů s materiálem preparátu vznikají různě detekovatelné složky. Podle putování paprsku po preparátu se mění podle charakteru povrchu úroveň signálu v detektoru. Ze signálů je pak sestavován výsledný obraz, který je tvořen pomocí sekundárního signálu – odražených nebo sekundárních elektronů. Zobrazení je proto považováno za nepřímou metodu. Jednou z hlavních předností je velká hloubka ostrosti a vznik rentgenového záření v preparátové komoře při vzájemném působení urychlených elektronů s hmotou preparátu. Zdrojem elektronů je elektronová tryska, nejčastěji wolframové žhavené vlákno umístěné ve Wehneltově válci. Mechanická clona slouží k vybírání pouze části elektronů, projekční čočka nám umožňuje zaostření a defektor svazku vytváří obraz. Tubus obsahuje jednu nebo více kondenzorových čoček, objektivovou čočku, vychylovací cívky rastrů a cívky stigmátorů pro korekci astigmatismu.
Tradičním výstupem je fotografie. Mikroskopy jsou kromě pozorovací obrazovky vybaveny fotomonitorem, ke kterému je připojen fotoaparát. K vytvoření obrazu na fotografickém filmu se používají fotony, takže lze použít i zcela normální černobílý fotografický materiál. Nové mikroskopy se standardně dodávají s digitálním záznamem obrazu a některé i s fotografickým záznamem.
Mezi výhody EM patří velké rozlišení (0,2nm), velká hloubka ostrosti (několik mm) a velké zvětšení, což umožňuje pozorovat i opravdu velmi malé částice. Také informace o topografii a materiálovém složení jsou v nejlepších dosažitelných kvalitách. Veškerý komfort zajišťuje také pohyb svazku elektronů, který lze řídit pomocí počítače.
K nevýhodám patří velké nároky na prostor a obsluhu a hlavně velká pořizovací cena. Podstatnou nevýhodou je fakt, že preparát musí být umístěn ve vakuu, což nám neumožňuje pozorovat živé organismy a také pořizování ultratenkých řezů.
Elektronového mikroskopu se využívá v lékařství při studiu virů a bakterií, mikroelektronice k vývoji a studiu čipů a polovodičových materiálů, průmyslu, materiálovém inženýrství ke zjištění povrchových defektů materiálů a ve vědě ke kvalitativní a kvantitativní prvkové analýze.
Elektronová mikroskopie je jednou z nejdůležitějších metod zkoumání ve virologii. Preparáty se pevně zachycují na niklovou nebo kadmiovou mřížku potaženou tenkou vrstvou, která propouští elektrony. Často používaná negativní barviva ke zvýraznění struktur jsou kyselina fosfowolframová, molybdenan amonný, uranyl acetát. Jako vnitřní standart pro určení velikosti nejčastěji používáme částice viru tabákové mozaiky a latexové částice.
Použitá literatura:
- http://www.paru.cas.cz/lem/book/index.html
- http://www.scienceworld.cz/sw.nsf/print/B51AB8E153B44E00C1256E970048FBB5
- http://encyklopedie.seznam.cz/heslo/191954-rastrovaci-elektronovy-mikroskop
- http://encyklopedie.seznam.cz/heslo/128040-elektronovy-mikroskop